為了避免雜菌污染，獲得微生物純培養物，培養基必須及時嚴格滅菌。通常采用高壓蒸汽滅菌。一般培養基用0. IMPa (121℃)維持15 ~ 30min即可徹di滅菌。長時間的高溫滅菌會使某些不耐熱的物質破壞，如使糖類物質形成氨基糖、焦糖。因此，含糖培養基常用0.05MPa (110℃) 滅菌20 ~ 30min某些對糖類要求更高的培養基，可先將糖過濾除菌或間歇滅菌，再與其他已滅菌的成分混合。長時間高溫滅菌也會使磷酸鹽、碳酸鹽與鈣、鎂鐵等陽離子形成難溶性化合物而產生沉淀。為了防止這類沉淀發生，可將這些物質分別滅菌，冷卻后再混合；也可在培養基中加入少量整合劑(0.01%乙二胺四乙酸，即EDTA)使金屬離子形成可溶性絡合物，防止沉淀的產生。高壓蒸汽滅菌一般使培養基 pH降低， 應在配制培養基時加以調節。
干熱滅菌和濕熱滅菌,干熱滅菌方法：包在鐵質容器內,進行高溫烘烤.濕熱用牛皮紙包起來放在高壓鍋中進行高壓滅菌.
濕熱滅菌、煮沸滅菌和過濾除菌,煮沸滅菌在電磁爐或者微波爐內進行煮沸即可,過濾除菌適用于不能高溫處理的培養.
高壓蒸汽滅菌：
高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養基在愛制備過程中混入各種雜菌，分裝后應立即滅菌，至少應在24h內完成滅菌工作。滅菌時一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時，滅菌15~30min即可。消毒時間不宜過長，也不能超過規定的壓力范圍，否則有機物質特別是維生素類物質就會在高溫下分解，失去營養作用，也會使培養基變質、變色，甚至難以凝固。
可將蒸餾水或自來水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無菌水。 滅菌后的培養基可放到培養室中預培養3d，若無污染現象，則證明滅菌是徹di的，可以使用。暫時不用的培養基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養基應在1周內用完，其他培養基最多也不要超過1個月。
過濾滅菌：
一些植物生長調節劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養基一起進行高溫滅菌，而要使用細菌過濾器濾去其中的雜菌。細菌過濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進行高壓滅菌。過濾后的溶液要立即加入培養基中，若為液體培養基，可在培養基冷卻至30℃時加入；若為固體培養基，必須在培養基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
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