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冰凍切片免疫熒光實驗步驟

1、冰凍切片固定

冰凍切片37℃烘烤10至20分鐘，控干水分，置于4%多聚甲醛固定30min。于PBS緩沖液中晃動洗滌3次，每次5分鐘。

2、抗原修復

將切片浸沒在升滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盆中，置于微波爐內進行抗原修復，修復條件：中火8min至沸——?；?min保溫——中低火7min（整個過程需防止修復液過度蒸發，切勿干片。

自然冷卻后，將切片置于PBS緩沖液中。然后在搖床上，晃動洗滌3次，每次5min。

3、畫圈血清封閉

切片稍甩干后，用組化筆在組織周圍畫圈，滴加組織自發熒光淬滅劑A液，室溫孵育30min，純水洗5分鐘，接著滴加BSA牛血清白蛋白，封閉30min。

4、加一抗

輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按比例配好的一抗后，切片平放于濕盒內4℃孵育過夜。

5、加二抗

切片浸沒在PBS緩沖液中，然后在搖床上，晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后，滴加熒光二抗，覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

6、DAPI復染細胞核

切片浸沒在PBS緩沖液中，晃動洗滌3次，每次5min。甩干后，在圈內滴加即用型DAPI染液，避光室溫孵育10min。

7、淬光組織自發熒光

切片置于PBS緩沖液中，晃動洗滌3次，每次5min。在圈內滴加組織自發熒光淬滅劑B液，避光室溫孵育5min，水洗10min。

8、封片

切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片，推薦使用遠慕生物配套試劑、耗材、儀器，實驗效果更佳！

冰凍切片免疫熒光結果判讀：

DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光或綠光等。